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冷凍電鏡Cryo-TEM詳解：樣品冷凍與成像原理

來源：時間：2024-08-02 09:55:41 瀏覽：1681次

冷凍電鏡Cryo-TEM詳解：樣品冷凍與成像原理

冷凍電鏡（Cryo-TEM）技術(shù)是一種能夠在低溫條件下對生物樣品進行成像的電子顯微技術(shù)。近年來，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，冷凍電鏡在生物科學研究領(lǐng)域取得了重大突破，為解析生物大分子結(jié)構(gòu)提供了強有力的手段。

一、樣品冷凍原理

1. 快速冷凍技術(shù)

冷凍電鏡的核心在于快速冷凍技術(shù)，它能將生物樣品迅速冷卻至液氮溫度（-196℃），使樣品中的水分子形成非晶態(tài)冰，從而保持生物樣品在近生理狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)?？焖倮鋬黾夹g(shù)主要包括以下兩種方法：

（1）高壓冷凍：將樣品置于高壓環(huán)境中，使水分子在冷凍過程中不易形成冰晶。這種方法適用于細胞、組織等較大體積的生物樣品。

（2）滴注冷凍：將樣品溶液滴注到冷凍載體上，如銅網(wǎng)格或微柵，然后迅速冷凍。這種方法適用于蛋白質(zhì)、病毒等較小體積的生物樣品。

2. 冷凍過程

冷凍電鏡的冷凍過程主要包括以下幾個步驟：

（1）樣品制備：將生物樣品稀釋至適當濃度，并添加冷凍保護劑（如甘油、乙二醇等）以降低冰晶形成的可能性。

（2）滴注樣品：將樣品溶液滴注到冷凍載體上，形成薄層。

（3）快速冷凍：采用高壓冷凍或滴注冷凍方法，使樣品迅速冷卻至液氮溫度。

（4）冷凍樣品轉(zhuǎn)移：將冷凍后的樣品轉(zhuǎn)移到冷凍傳輸裝置，如冷凍傳輸桿，以便在低溫條件下進行電鏡觀察。

二、成像原理

1. 電子束與樣品相互作用

冷凍電鏡采用高能電子束對冷凍樣品進行照射，電子束與樣品中的原子發(fā)生相互作用，產(chǎn)生信號。這些信號包括透射電子、彈性散射電子、非彈性散射電子等。其中，透射電子攜帶了樣品的結(jié)構(gòu)信息，是成像的主要信號。

2. 成像模式

冷凍電鏡的成像模式主要包括以下幾種：

（1）透射電子顯微鏡（TEM）模式：通過檢測透射電子，獲得樣品的二維圖像。在冷凍電鏡中，TEM模式主要用于觀察樣品的整體形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

（2）掃描透射電子顯微鏡（STEM）模式：利用聚焦電子束掃描樣品，獲得樣品的元素分布信息。STEM模式在冷凍電鏡中可用于分析樣品的化學成分。

（3）低劑量成像：為了減少電子束對樣品的損傷，冷凍電鏡采用低劑量成像技術(shù)。通過降低電子束的劑量，延長樣品在電子束下的壽命，從而獲得高質(zhì)量的圖像。

3. 圖像處理與分析

冷凍電鏡獲得的原始圖像需要經(jīng)過一系列處理和分析，才能提取出有用的結(jié)構(gòu)信息。主要包括以下步驟：

（1）圖像校正：消除圖像中的畸變、失真等，提高圖像質(zhì)量。

（2）圖像分割：將圖像中的目標物體與背景分離，便于后續(xù)分析。

（3）三維重建：根據(jù)二維圖像，采用計算機算法重建樣品的三維結(jié)構(gòu)。

（4）結(jié)構(gòu)解析：對重建的三維結(jié)構(gòu)進行解析，揭示生物大分子的空間構(gòu)象和相互作用。

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