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項(xiàng)目介紹

通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究以揭示生物學(xué)現(xiàn)象或疾病發(fā)生的分子機(jī)制是高通量組學(xué)研究的一個(gè)常用策略。利用高通量測(cè)序技術(shù)在全面快速得到基因表達(dá)譜的同時(shí)，還可以通過(guò)測(cè)定的序列信息精確地分析轉(zhuǎn)錄本的SNP、可變剪接等序列及結(jié)構(gòu)變異。

技術(shù)特點(diǎn)

1.除了計(jì)算基因的表達(dá)水平，更可以檢測(cè)轉(zhuǎn)錄本的序列和構(gòu)變異。

2.測(cè)序深度的增加可以獲得更廣的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍，能夠同時(shí)鑒定和定量高豐度轉(zhuǎn)錄本和低豐度轉(zhuǎn)錄本，信號(hào)強(qiáng)度的跨度可達(dá)6個(gè)數(shù)量級(jí)。

3. 除了檢測(cè)已知轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平外，還能夠發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本。

4. 在應(yīng)用于尚無(wú)參考基因組的物種時(shí)，可以通過(guò)從頭組裝發(fā)現(xiàn)新基因。

實(shí)驗(yàn)流程

圖中深色為該實(shí)驗(yàn)流程

分析流程

標(biāo)準(zhǔn)分析

（1）數(shù)據(jù)過(guò)濾及比對(duì)分析

（2）轉(zhuǎn)錄本拼接

高級(jí)分析

（3）差異表達(dá)基因篩選

（4）差異表達(dá)基因聚類分析

（5）使用GO/KEGG分析，推測(cè)突變基因富集在哪些代謝通路。

樣品要求

樣本要求

RNA濃度≥20ng/ul ，總量≥2ug

細(xì)胞數(shù)≥5X10⁶

項(xiàng)目案列

常見問(wèn)題

真核轉(zhuǎn)錄組常規(guī)建庫(kù)流程

1）通過(guò)磁珠和mRNA的polyA結(jié)構(gòu)將mRNA分離出來(lái)；

2）mRNA片段化；

3）mRNA反轉(zhuǎn)錄為雙鏈結(jié)構(gòu)，第二鏈cDNA合成時(shí)，其中的堿基T，被替換成U，從而達(dá)到鏈特異性文庫(kù)的目的；

4）5’末端修復(fù)、3’末端加A；

5）加接頭；

6）選擇特異長(zhǎng)度回收，一般為300bp；

7）PCR；

8）上機(jī)測(cè)序。

原核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序用到哪些試劑？

1）RNA提取：Trizol Reagent；

2）核糖體RNA去除：IlluminaRibo-Zero? Magnetic Kit；

3）文庫(kù)構(gòu)建：IlluminaTruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit；

4）上機(jī)測(cè)序IlluminaNextSeq?500 High Output Kit v2。

什么是小RNA測(cè)序？

Small RNA測(cè)序，研究某一物種特定組織在特定狀態(tài)下的已知SmallRNA，也可發(fā)現(xiàn)新的或該物種的Small RNA并預(yù)測(cè)其靶基因，為研究Small RNA的功能及此物種的基因調(diào)控機(jī)制提供了有力工具。Small RNA主要包括微RNA（miRNA）、小干擾RNA（siRNA）、與piwi相互作用的RNA（piRNA）三類。

哪些物種可以研究lncRNA？

要做lncRNA分析，對(duì)物種有以下要求：

a. 物種為真核生物；

b. 物種具有參考基因組；

c. 具有較為完整的注釋。

為什么CircRNA測(cè)序的研究比較熱？

1）多角度闡述分子生物學(xué)問(wèn)題的需要；

2）從新的角度發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致樣本存在差異的需要；

3）尋找影響疾病發(fā)生的分子標(biāo)記；

4）探究circRNA的未知功能；

5）尋找導(dǎo)致microRNA表達(dá)發(fā)生變化的機(jī)理。

全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是怎么做的？

全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是將樣品分為兩份，構(gòu)建2個(gè)文庫(kù)，1個(gè)小RNA文庫(kù)（包含miRNA）和一個(gè)去除核糖體的鏈特異性文庫(kù)（包含mRNA，lncRNA，和circRNA），然后分別上機(jī)測(cè)序，最后主要獲得4類RNA——miRNA，lncRNA，mRNA，circRNA的序列信息。

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2024-05-11