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項(xiàng)目介紹

生物透射電鏡介紹：透射電鏡，即透射電子顯微鏡（Transmission Electron Microscope，簡稱 TEM），是一種最高分辨率可達(dá)到0.1-0.2納米的顯微鏡，是觀察和研究超微結(jié)構(gòu)的重要工具。在生物科學(xué)研究方面，透射電鏡可用來觀察細(xì)胞整體結(jié)構(gòu)、細(xì)胞亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，包括（植物）細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞核和各種細(xì)胞器的變化、外源物質(zhì)（如病原微生物、各種納米顆粒）與細(xì)胞的關(guān)系，如外源物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的方式、在細(xì)胞內(nèi)的分布情況、細(xì)胞對外界刺激的反應(yīng)（包括自噬、凋亡、壞死等）。

1. 主要用于生物樣品（細(xì)胞，生物組織）材料內(nèi)部形貌的分析和研究；

2. 對樣品進(jìn)行包埋，超薄切片，染色等工序，制成TEM樣品；

3. 通過透射電鏡觀察樣品內(nèi)部的組織形貌。

預(yù)約前請務(wù)必閱讀

前處理方法：

您需要提供的樣品：收集細(xì)胞/組織取樣（新鮮迅速取材），置于1.5ml尖底離心管內(nèi)，加入預(yù)冷的終濃度為2.5%的戊二醛和2%多聚甲醛固定液（固定液加到?離心管，使樣品完全浸沒在固定液中），放置于4℃過夜，請不要倒棄固定液，一般固定12h或過夜后可寄送。

具體取材及固定方法如下：

1.對于細(xì)胞類，106以上的細(xì)胞，用新鮮的培養(yǎng)液興奮細(xì)胞，用細(xì)胞刮刀刮下來或者酶消化，加入預(yù)冷的終濃度為2.5%的戊二醛和2%多聚甲醛溶液，固定半小時(shí)，1500-3000轉(zhuǎn)離心，5-10min，收集細(xì)胞于管底肉眼可見黃豆或者綠豆粒大小，棄上清，沿管壁緩慢加入4℃新的固定液，然后放入4°C冰箱過夜。

2.對于組織類，新鮮取材，取材位置準(zhǔn)確，組織大小盡量在1-2mm3（長1-5mm×寬1mm×高1mm），離體取材后請盡快投入4℃預(yù)冷的固定液中，然后放入4°C冰箱固定過夜。

3.對于細(xì)菌類，吸取OD0.5-0.8的培養(yǎng)物，加入預(yù)冷的終濃度為2.5%的戊二醛和2%多聚甲醛溶液，固定半小時(shí)，3000-5000轉(zhuǎn)離心，5-10min，離心后棄上清，收集菌體沉淀于管底黃豆大小，可以用預(yù)冷的pH7.2的PB洗1-2次，棄上清，沿管壁緩慢加入新的4℃預(yù)冷的固定液，然后放入4°C冰箱過夜。

樣本編號(hào)建議按照字母或數(shù)字來，標(biāo)記清晰，樣本量充足。

*固定液的量請參考上圖，加至箭頭所示位置，細(xì)胞、細(xì)菌、真菌樣品用尖底離心管

*如為其他特殊樣品，需要特殊的固定方式和前處理方式，請與工作人員溝通確認(rèn)。

樣品要求

1. 樣品需要用戊二醛固定，一般固定2小時(shí)即可冰袋運(yùn)輸（特殊樣品需要固定時(shí)間長一些），戊二醛的量要多，樣品管保留一定量的空氣。

2. EP管用封口膜封好（防止管口漏液），EP管外用泡沫包好，避免低溫冰凍造成樣品結(jié)冰。

3. 樣品中固體含量至少一顆芝麻粒大小，細(xì)胞和菌類要米粒大??；生物新鮮組織樣品取材到相應(yīng)濃度的戊二醛固定液里，不益超過1min，以便較少自融，戊二醛需要預(yù)冷4-10℃再使用；

4. 一般送樣方式為4℃冰袋冷藏運(yùn)輸，冷凍送樣需要在訂單中特別指明。

5. 該項(xiàng)目不支持回收，請自行留樣。

6. 可測試細(xì)菌、細(xì)胞、生物組織等樣品。

7.請盡量注明圖片標(biāo)尺或具體需要拍攝的內(nèi)容，可輸出10um、5um、2um、1um、500nm、200nm和100nm的標(biāo)尺；如未注明,實(shí)驗(yàn)室不接受因標(biāo)尺問題導(dǎo)致的免費(fèi)補(bǔ)拍或重拍。

項(xiàng)目案列

TEM觀察納米顆粒在細(xì)胞內(nèi)具體的結(jié)合位點(diǎn)

銹菌的TEM圖

動(dòng)物組織的TEM圖

某細(xì)菌的TEM圖

常見問題

為什么通過光鏡（免疫熒光等）和分子實(shí)驗(yàn)（ELISA/WB等）觀察到自噬、凋亡等現(xiàn)象，摸索出信號(hào)最強(qiáng)的時(shí)間點(diǎn)取材，結(jié)果電鏡下細(xì)胞不是結(jié)構(gòu)爛就是沒有期待的結(jié)構(gòu)呢？可能的原因有哪些？

答：光鏡和分子水平的變化與超微結(jié)構(gòu)變化不完全平行！是基本上從來都不準(zhǔn)確同步的，所以已經(jīng)做了其他實(shí)驗(yàn)后想來看自噬和凋亡的，不一定能看到，鐵死亡、外泌體等都有這個(gè)問題。

可能的原因有：

1.光鏡分辨率不夠，看上去陽性的東西，可能根本不在預(yù)期結(jié)構(gòu)上。比如，線粒體相關(guān)的某標(biāo)記物，光鏡下看到胞質(zhì)里陽性顆粒很多了，結(jié)果電鏡下完全沒有。精細(xì)實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的其實(shí)是某些溶酶體。

2.生理或病理過程本身的原因。比如有老師來看凋亡，給了熒光照片，胞核標(biāo)記物超級(jí)清楚，結(jié)果電鏡下細(xì)胞很爛。也有給了WB結(jié)果，選的陽性最強(qiáng)的時(shí)段取材，結(jié)果電鏡下細(xì)胞完好。他們都是同一板細(xì)胞分取的?？赡芊肿咏Y(jié)果反映的是表達(dá)沒有，表達(dá)了不見得正在發(fā)揮作用，形態(tài)還是好的。熒光都看到了，那細(xì)胞崩裂已經(jīng)開始，鏡下就好不了。

動(dòng)物普通組織取材、送樣

取材原則：切薄并盡快投入固定液；注意下述要求。

1. 請盡快固定。動(dòng)物組織最好在離體后1 min內(nèi)開始固定。

2. 非灌注的組織，厚度不超過4 mm，請用恰當(dāng)方式（比如切寬薄片）體現(xiàn)位置和層次關(guān)系。盡量不要事先切成很小的顆粒。

3. 請用鋒利薄刀片切組織，朝一個(gè)方向劃，不要來回切割，不要擠壓、拉扯。

4. 含有食物殘?jiān)ㄈ缦溃?、大量血液（如心?。┗蚱渌じ轿铮ㄈ缛橄俚龋┑慕M織，請用生理鹽水快速漂洗，再投入固定液。

5. 請保證固定液量充足。固定液和組織的體積比不小于20 : 1。

6. 最初的30 min以后，最好在4 ℃的固定液中浸泡，嚴(yán)禁結(jié)冰（太靠近冰箱后壁或冰袋運(yùn)輸都可能使組織結(jié)冰。冬季寧可常溫送樣）。

備注：

（1）組織尺寸和容器關(guān)系（只裝一個(gè)的參考標(biāo)準(zhǔn)）：

芝麻到綠豆大小（如小鼠腎上腺）：請用1.5 ml EP管；

黃豆大?。ㄐ∈竽I臟）：請用5 ml離心管；

鋪展面積類似蠶豆大小的組織片：請用平底的25 ml廣口瓶；

（2）每個(gè)容器含有N個(gè)組織時(shí)：容器體積要適當(dāng)增大，組織不要相互擠壓變形。

培養(yǎng)細(xì)胞常規(guī)簡易取材、送樣？

1. 最好刮取細(xì)胞，收集在離心管中，1500 rpm離心5 ~ 10 min（該參數(shù)可按自己的經(jīng)驗(yàn)調(diào)整，目的是不損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)的情況下去掉培養(yǎng)液成分）。

2. 棄上清，加入固定液重懸細(xì)胞。

3. 細(xì)胞懸液盡快（1分鐘內(nèi)，久了離心難以緊固）轉(zhuǎn)移至1.5 ml尖底EP管，立即以10000 r/min離心12 min（該參數(shù)適用于一般小型臺(tái)式離心機(jī)，不可隨意更改，務(wù)必使細(xì)胞離緊不散）；離緊后的細(xì)胞約半顆綠豆大小，切不可太大。

4. 靜置15 min，然后小心棄上清，再沿管壁緩慢加入室溫或4 ℃固定液（不可沖擊、吹散細(xì)胞）。

5. 在4 ℃保存或運(yùn)輸。嚴(yán)禁結(jié)冰（太靠近冰箱后壁或冰袋運(yùn)輸都可能使組織結(jié)冰。冬季寧可常溫送樣）。

備注：

（1）對細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)沒有特殊觀察要求的動(dòng)物細(xì)胞，均可按本法操作，比如精子、血液、脫落細(xì)胞等。薄壁細(xì)菌也可按本法處理。

（2）觀察細(xì)胞連接的實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用消化的方法收集細(xì)胞。

（3）不耐受高速離心的樣品，請以懸液送樣。盡可能裝滿，以減少運(yùn)輸途中的震蕩。

（4）厚壁真菌等離心緊固后不易滲透的樣品，也請以懸液送樣，要求同上。

固定液類型及介紹？

大多數(shù)動(dòng)物組織和培養(yǎng)細(xì)胞，提供2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液。專門觀察神經(jīng)髓鞘的，提供3%戊二醛＋Plus輔劑（臨用前5 min內(nèi)混合）；觀察厚壁真菌或細(xì)菌芽孢等，提供K-T固定液。具體根據(jù)樣本類型選擇合適的固定液，并非完全統(tǒng)一。

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