双腿间已经湿成一片,亚洲啪啪综合AV一区,厨房的春潮A片,日本一道久久高清国产

快捷下單入口關于合作招聘新人手冊會員中心

熱線：400-152-6858

測試狗科研服務

預存免費試測登錄

Document

當前位置：文庫百科 ? 文章詳情

超強干貨丨一文看懂WB、qPCR生物測試，內(nèi)含常見問題（附答案）

來源：測試GO 時間：2023-02-13 09:53:10 瀏覽：8107次

01

蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）

實驗簡介

蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）又稱免疫印跡（immunoblotting），是采用印跡技術將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，再根據(jù)抗原-抗體的特異性結合，檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法，該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。

實驗原理

WB實驗是通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）將混合蛋白質(zhì)樣品分離后，利用特殊虹吸或電場裝置印跡至固相介質(zhì)（例如PVDF膜）上，再以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與相對應的第一抗體特異性結合，之后再與酶或同位素標記的第二抗體相結合，最終通過底物顯色或放射自顯影來檢測特異性目的基因表達的蛋白成分。

實驗流程

蛋白質(zhì)印跡常見問題

一、為什么蛋白質(zhì)印跡條帶大小與預期的不同？

蛋白質(zhì)印跡是一種基于蛋白質(zhì)大小來分離蛋白質(zhì)的技術。一般來講，蛋白質(zhì)越小，在膠上的遷移速度越快。但遷移速度也受其它因素的影響，因此，觀察到的實際條帶大小可能與預測的不同。

常見的因素包括：

1.翻譯后修飾：例如磷酸化、糖基化等，可增加蛋白質(zhì)大小。

2.翻譯后切割：例如許多蛋白先被合成為前蛋白，然后被切割產(chǎn)生活性形式，例如前半胱天冬酶。

3.剪接變體和異形體：可變剪接和異形體可能從同一基因產(chǎn)生不同大小的蛋白質(zhì)。

4.相對電荷-氨基酸（帶電和不帶電）多聚體組分，例如蛋白質(zhì)的二聚化。這種情況通常在還原條件下需要防止，但強相互作用會導致較大的條帶出現(xiàn)。

二、應該上樣多少樣品？

細胞裂解物、膜裂解物和核裂解物：每孔上樣20-30g總蛋白?？筛鶕?jù)測試樣品中的蛋白質(zhì)表達水平進行一些優(yōu)化。純化蛋白（重組或內(nèi)源）：上樣10至100ng蛋白。

三、蛋白樣本為什么要進行還原和變性？

為了使樣本被還原和變性，樣品緩沖液中會含有十二烷基硫酸鈉(SDS)和β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)。SDS是一種變性劑，用來打破蛋白的高級結構，變成初級的氨基酸結構，同時以恒定的質(zhì)量比包被蛋白質(zhì)，使其帶上負電荷。這一恒定的負電荷比是下一步凝膠電泳分離的關鍵。β-巰基乙醇和DTT都是還原劑，用來斷開蛋白自身的二硫鍵，進一步使蛋白質(zhì)變成線性結構。順便提一下，有些抗體只能夠識別目標蛋白的天然結構，在這種情況下，樣本不需要被還原和變性，所以還原和變性的步驟可以省略。但是，大多數(shù)蛋白質(zhì)印跡分析都需要在還原和變性的體系中進行。

四、轉(zhuǎn)膜選擇半干轉(zhuǎn)還是濕轉(zhuǎn)？

常用的轉(zhuǎn)印方法有兩種，濕法和半干法。這兩種方法的主要區(qū)別在于，濕法轉(zhuǎn)印中，夾心層被浸沒在注有電轉(zhuǎn)緩沖液的槽中，而在半干法中，夾心層被直接置于陰極與陽極之間。半干法較快，但膜可能會干掉導致蛋白無法轉(zhuǎn)印。濕法轉(zhuǎn)印用時較長，但對于大分子蛋白或疏水蛋白等較難轉(zhuǎn)印的蛋白，這個方法更適合。

五、為什么檢測重組蛋白時難以獲得條帶？

抗體檢測重組蛋白質(zhì)時，存在難以克服的困難，有必要加以考慮。所以推薦確保樣品中表達的重組蛋白包含所用抗體的免疫原序列。同時，如果重組蛋白帶有標簽，標簽可能阻止抗體接近表位。盡可能讓標簽位于重組蛋白的C或N末端，以降低這種情況發(fā)生的可能性（而不是位于蛋白質(zhì)的閱讀框中間）。

六、牛奶和 BSA 封閉有區(qū)別？

抗體可能對封閉劑敏感，一般來講，BSA會產(chǎn)生更清晰的結果，因為BSA含有較少的蛋白，因而抗體較少與其發(fā)生交叉反應。但并非總是如此，有些抗體在牛奶中的效果更好，因為牛奶含有更多種類的封閉蛋白，能封閉更多不同類型的蛋白質(zhì)。

七、能否用室溫下孵育一抗 1 小時代替 4 ℃ 過夜孵育？

蛋白質(zhì)印跡中一抗孵育時間需要用戶進行最終優(yōu)化。一般來講，4 ℃ 過夜孵育將產(chǎn)生更高效、更特異的染色。但許多抗體在室溫下孵育1或2小時效果也非常好。

實驗結果常常出現(xiàn)的問題

一、無信號

1.一抗和二抗不相容，使用針對一抗來源物種產(chǎn)生的二抗（例如，一抗來源于兔，使用抗兔二抗）。

2.結合到目標蛋白的一抗或二抗不足，使用更高濃度的抗體，或在4℃下孵育更長時間（例如過夜孵育）。

3.封閉劑和一抗或二抗之間發(fā)生交叉反應，使用溫和去垢劑，例如Tween20，或更換封閉劑（常用的封閉劑是牛奶、BSA、血清或明膠）。

4.一抗不識別測試物種中的蛋白查看數(shù)據(jù)表或進行BLASTp比對，檢查抗體是否應與目標蛋白反應。

5.抗原不足，每個泳道上樣至少20–30μg蛋白，使用蛋白酶抑制劑。

6.組織中目標蛋白豐度不夠，利用富集步驟使信號達到最大（例如，對于核蛋白，制備核裂解物）。

7.蛋白轉(zhuǎn)膜效果差，用可逆染料（例如麗春紅）檢查轉(zhuǎn)膜情況。如果蛋白未有效轉(zhuǎn)膜，檢查轉(zhuǎn)膜方向是否正確。如果使用PVDF膜，確保先將膜預浸在甲醇中，然后預浸在轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

8.膜洗滌過度減少洗滌步驟的數(shù)量或縮短洗滌步驟的時間。

二、“微笑”︶條帶呈笑臉狀

說明凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好；電泳系統(tǒng)溫度偏高，這種情況在用較厚凝膠時常發(fā)生。

三、“皺眉”︵條帶呈皺眉狀

這種現(xiàn)象常常是由于裝置不合適，特別是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全就會產(chǎn)生這種現(xiàn)象。

四、“拖尾”現(xiàn)象和背景高

拖尾是電泳中最常見的現(xiàn)象，常常是由于樣品溶解不佳引起的。解決辦法為加樣前離心，選用合適的樣品緩沖液和凝膠緩沖液，加增溶輔助試劑，降低凝膠濃度。背景高是封閉時間不夠，延長封閉時間。優(yōu)化封閉試劑的類型和濃度；封閉試劑和抗體有交叉反應，則需要更換封閉試劑。磷酸化抗體不能使用含有酪蛋白的封閉試劑，推薦BSA封閉；一抗/二抗?jié)舛忍邥r應降低抗體濃度。洗膜不充分，5*3mins，多次短時間的洗膜；曝光時間過長，應縮短曝光時間。出現(xiàn)干膜現(xiàn)象保證膜充分浸透，避免出現(xiàn)干膜。

五、非特異性條帶現(xiàn)象

在標本制備時，二聚體或者多聚體應增加上樣前煮沸變性時間；蛋白不同剪切體或者異構體存在；若蛋白樣品降解，應使用新制備的標本，標本中加入新配制的蛋白酶抑制劑。上樣品時，上樣量過大，應減少上樣量。封閉不充分，優(yōu)化封閉時間和封閉試劑濃度?？贵w孵育和檢測一抗/二抗?jié)舛仁欠襁^高，降低抗體濃度。

測試案例

02

實時定量PCR（RT-qPCR）

實驗簡介

實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質(zhì)檢測每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析。

實驗原理

以cDNA為模板進行PCR，在PCR擴增過程中，通過收集熒光信號，對PCR進程進行實時檢測。由于在PCR擴增的指數(shù)時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關系，所以可以定量。在實時PCR擴增過程中，熒光信號被收集，轉(zhuǎn)化為成為擴增和熔解曲線。具體數(shù)據(jù)就是基線，熒光閾值和Ct值。

1.基線（baseline）：一般來講，第3-15個循環(huán)的熒光值就是基線，是由于測量的偶然誤差引起的。

2.閾值（threshold）：閾值一般是基線的標準偏差的10倍。在實際操作中也可以手動調(diào)節(jié)，位于指數(shù)期就可以。

3.Ct值（Ct value）：Ct值就是熒光值達到閾值時候的PCR循環(huán)次數(shù)。所以是一個沒有單位的參數(shù)。跟初始模板的量呈反比。

檢測方法