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想get更多免疫檢測技術(shù)？毛細(xì)管電泳了解一下

來源：時(shí)間：2022-12-06 09:46:33 瀏覽：3520次

毛細(xì)管電泳（CE，capillary electrophoresis），又稱高效毛細(xì)管電泳（HPCE，high performance capillary electrophoresis）或毛細(xì)管電分離法（CESM，capillary electro-separation method）。毛細(xì)管電泳包容電泳、色譜及其交叉內(nèi)容，是一類以毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力，以樣品的多種特性（電荷、大小、等電點(diǎn)、極性、親和行為、相分配特性等）為根據(jù)的分離分析技術(shù)。毛細(xì)管電泳研究正在向多種前沿領(lǐng)域推廣應(yīng)用，其中 DNA 與 RNA 分析、復(fù)雜藥物分析、環(huán)境分析、醫(yī)學(xué)(特別是代謝組學(xué)與臨床醫(yī)學(xué))研究、蛋白質(zhì)組（多維）分離、糖組分析、手性分離、單細(xì)胞分析等工作進(jìn)展很快。

1.毛細(xì)管電泳的基本理論

一、電泳

在電解質(zhì)溶液中，位于電場中的帶電離子在電場力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象，稱之為電泳。

1808年，Reuss（俄國）首次發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象。

1937年，Tiselius（瑞典）將電泳用于人血清蛋白質(zhì)混合液的分離：發(fā)現(xiàn)樣品的遷移速度和方向由其電荷和淌度決定；這是第一次實(shí)現(xiàn)自由溶液電泳，同時(shí)他也發(fā)明了第一臺電泳儀。

1948年，Tiselius因?qū)﹄娪痉治龊臀椒椒ǖ难芯?，特別是發(fā)現(xiàn)了血清蛋白的組分而獲得1948年諾貝爾化學(xué)獎。

二、傳統(tǒng)電泳

利用電泳現(xiàn)象對某些化學(xué)或生物物質(zhì)進(jìn)行分離分析的方法和技術(shù)叫做電泳法或電泳技術(shù)。傳統(tǒng)電泳具有以下分類

（1）按形狀分類：U 型管電泳、柱狀電泳、板電泳。

（2）按載體分類：濾紙電泳、瓊脂電泳、聚丙烯酰胺電泳、自由電泳。

傳統(tǒng)電泳分析，操作繁瑣，分離效率低，定量困難，因此無法與其它分析相比。1981年，Jorgenson 和 Luckas 用 75 μm 內(nèi)徑石英毛細(xì)管進(jìn)行電泳分析，柱效高達(dá)40萬/米，這促進(jìn)電泳技術(shù)發(fā)生了根本變革，迅速發(fā)展成為可與 GC、HPLC 相媲美的嶄新的分離分析技術(shù)---毛細(xì)管電泳。

三、毛細(xì)管電泳

毛細(xì)管電泳在傳統(tǒng)電泳技術(shù)上采取了兩項(xiàng)重要改進(jìn)：

（1）采用了25-100 μm內(nèi)徑的毛細(xì)管。標(biāo)準(zhǔn)毛細(xì)管的外徑為375 μm，有些管的外徑為160 μm。毛細(xì)管的特點(diǎn)是：容積?。ㄒ桓?00 cm×75 μm 管子的容積僅4.4 μL）；側(cè)面/截面積比大，因而散熱快、可承受高電場（100-1000 V/cm）；可使用自由溶液、凝膠等為支持介質(zhì)；在溶液介質(zhì)下能產(chǎn)生平面形狀的電滲流。

（2）采用了高達(dá)數(shù)千伏的電壓。毛細(xì)管的采用使產(chǎn)生的熱量能夠較快散發(fā)，大大減小了溫度效應(yīng)，使電場電壓可以很高；電壓升高，電場推動力大，又可以進(jìn)一步使柱徑變小，柱長增加；毛細(xì)管電泳的柱效遠(yuǎn)高于HPLC，理論塔板數(shù)高達(dá)幾十萬塊/米，特殊柱子可以達(dá)到數(shù)百萬。

2.毛細(xì)管電泳的原理

一、基本原理

帶電離子在電場中定向移動時(shí)不同的離子具有不同的遷移速度，物質(zhì)離子在電場中的差速遷移是電泳分離的基礎(chǔ)。

當(dāng)帶電離子以速度 v 在電場中移動時(shí)，受到大小相等、方向相反的電場推動力（FE=qE）和平動摩擦阻力（F=fv）的作用，得到 qE = fv（q為離子所帶有效電荷，E為電場強(qiáng)度，v為離子在電場中的遷移速度，f為平動摩擦系數(shù)）。

對于球形離子，f=6πηγ，所以遷移速度 v=qE/6πηγ。

二、電滲透現(xiàn)象與電滲流

在電泳過程中，當(dāng)固體與液體接觸時(shí)，固體表面由于某種原因帶一種電荷，則因靜電引力使其周圍液體帶有相反電荷，在液-固界面形成雙電層（圖2），二者之間存在電位差。當(dāng)液體兩端施加電壓時(shí)，就會發(fā)生液體相對于固體表面的移動，這種液體相對于固體表面的移動的現(xiàn)象叫電滲現(xiàn)象。電滲現(xiàn)象中整體移動著的液體叫電滲流（electroosmotic flow，簡稱EOF）。

電滲透的方向取決于毛細(xì)管內(nèi)表面電荷的性質(zhì)：

（1）內(nèi)表面帶負(fù)電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向負(fù)極

（2）內(nèi)表面帶正電荷，溶液帶負(fù)電荷，電滲流流向正極

以石英毛細(xì)管柱為例，內(nèi)充液pH＞3時(shí)，表面電離成-SiO-，管內(nèi)壁帶負(fù)電荷，形成雙電層。在高電場的作用下，帶正電荷的溶液表面及擴(kuò)散層向陰極移動，由于這些陽離子實(shí)際上是溶劑化的，故將引起柱中的溶液整體向負(fù)極移動。

改變電滲流方向的方法：

（1）毛細(xì)管改性：表面鍵合陽離子基團(tuán)。

（2）加電滲流反轉(zhuǎn)劑：內(nèi)充液中加入大量的陽離子表面活性劑，使石英毛細(xì)管壁帶正電，溶液表面帶負(fù)電。

在毛細(xì)管電泳中，電滲流的速度約等于一般離子電泳速度的5-7倍，因此控制電滲流非常重要。陽離子運(yùn)動方向與電滲流一致，陰離子運(yùn)動方向與電滲流相反，中性粒子運(yùn)動方向與電滲流一致，如圖3所示。

3.毛細(xì)管電泳儀

一、工作原理

毛細(xì)管電泳儀以毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力，依據(jù)樣品中各組分的淌度（單位電場強(qiáng)度下的遷移速度）和分配行為的差異而實(shí)現(xiàn)各組分分離。

二、主要構(gòu)造

毛細(xì)管電泳儀的基本結(jié)構(gòu)包括一個(gè)高壓電源，一根毛細(xì)管，一個(gè)檢測器及兩個(gè)供毛細(xì)管兩端插入而又可和電源相連的緩沖液貯瓶，如圖5所示。

（1）高壓電源

毛細(xì)管電泳儀的高壓電源是穩(wěn)定、連續(xù)可調(diào)的直流電源；可恒壓（電壓范圍為0-30千伏）、恒流、恒功率輸出；具有電場強(qiáng)度程序控制系統(tǒng)；電壓穩(wěn)定性達(dá)到0.1%；能做到電源極性易轉(zhuǎn)換。

（2）毛細(xì)管柱

毛細(xì)管是CE分離的心臟，理想的毛細(xì)管必須電絕緣、紫外/可見光透明和富有彈性，目前可以使用的有塑料管、玻璃管、石英管等，其中彈性熔融石英毛細(xì)管被普遍使用。毛細(xì)管柱內(nèi)徑一般為20-75 μm，外徑350-400 μm，長度≤1m。

毛細(xì)管上具有檢測窗口，一般使用的外涂聚酰亞胺的石英毛細(xì)管由于聚酰亞胺涂層不透明，必須使用硫酸腐蝕法、灼燒法、刀片刮除法等對涂層進(jìn)行剝離得到檢測窗口。

（3）緩沖液池

緩沖液池要求化學(xué)惰性，機(jī)械穩(wěn)定性好。緩沖液內(nèi)含電解質(zhì)，充填于緩沖液池和毛細(xì)管中，通過電極、導(dǎo)線與電源連通，是分離室中的導(dǎo)體。

（4）檢測器

檢測器要求具有極高的靈敏度，可柱端檢測，檢測器、數(shù)據(jù)采集和計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理一體化。CE具有多種檢測方法，比如光吸收法、電化學(xué)法、電導(dǎo)法、化學(xué)發(fā)光法、磷光法、熒光法、質(zhì)譜法等，其中紫外吸收已經(jīng)非常成熟，是絕大多數(shù)商品儀器的主力檢測手段，部分商品儀器采用激光誘導(dǎo)熒光檢測法（LIF）和高頻電導(dǎo)檢測法（hfCD）。紫外吸收法既能采用柱上檢測方式（圖6），也可采用柱后檢測方式（圖7）。

三、進(jìn)樣方式

（1）壓力進(jìn)樣：壓力進(jìn)樣要求毛細(xì)管的填充介質(zhì)具有流動性，比如溶液等。將毛細(xì)管的兩端置于不同壓力環(huán)境中時(shí)，管中溶液即能流動，將樣液帶入。利用壓縮空氣可以實(shí)現(xiàn)正壓進(jìn)樣，并能和毛細(xì)管清洗系統(tǒng)共享，因此商業(yè)化的儀器常采用此法。壓力進(jìn)樣沒有偏向問題，但選擇性差，樣品及其背景都同時(shí)被引進(jìn)管中，對后續(xù)分離可能產(chǎn)生影響。

（2）電動進(jìn)樣：當(dāng)把毛細(xì)管的進(jìn)樣端插入樣品溶液中并加上電場E時(shí)，組分就會遷移進(jìn)入管內(nèi)。電動進(jìn)樣對毛細(xì)管內(nèi)的填充介質(zhì)沒有特別要求，能夠完全自動化操作，也是商品儀器必備的進(jìn)樣方法。但是電動進(jìn)樣對離子組分存在進(jìn)樣差別，會降低分析的準(zhǔn)確性和可靠性。

（3）擴(kuò)散進(jìn)樣：利用濃差擴(kuò)散原理可將樣品引入毛細(xì)管。擴(kuò)散進(jìn)樣對管內(nèi)介質(zhì)沒有任何限制，具有雙向性，在樣品分子進(jìn)入毛細(xì)管的同時(shí)，管中的背景物質(zhì)也向管外擴(kuò)散，能抑制背景干擾，提高分離效率。

四、分離方式

毛細(xì)管電泳有許多不同的模式，因而在分離樣品前必須選擇合適的分離模式以達(dá)到最佳的分離結(jié)果。根據(jù)簡單性原則，首先應(yīng)該考慮自由溶液分離模式，最后才考慮填充形式的分離模式，如圖8所示。

不同的分離模式所采用的分離機(jī)理有所不同，如圖9所示。

4.毛細(xì)管電泳的應(yīng)用

毛細(xì)管電泳分析技術(shù)發(fā)展迅速，具有分離效率高、所需樣品少、應(yīng)用范圍廣、分析成本低等諸多優(yōu)點(diǎn)，是生物化學(xué)、分析化學(xué)、環(huán)境分析中備受關(guān)注的分離分析技術(shù)之一。

一、手性分析

在現(xiàn)代社會中，與人類健康息息相關(guān)的醫(yī)藥生產(chǎn)必須考慮手性問題，國際科學(xué)界十分重視手性藥物的分離分析，毛細(xì)管電泳是一種簡單高效的手性分析方法。

實(shí)例：柯諾辛堿B（Corynoxine B）具有降壓,抗心律失常,保護(hù)腦缺氧缺血的作用?？轮Z辛堿（Corynoxine）是柯諾辛堿B異構(gòu)體，在不同的神經(jīng)元細(xì)胞系誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，結(jié)構(gòu)如圖10所示。Zhiying Wang等人[1]以環(huán)糊精（HP- β -CD）和谷氨酸（TBA-L-Glu）用作分離系統(tǒng)的添加劑，建立了一種靈敏、快速，有效的方法，用于毛細(xì)管電泳中的場放大樣品堆疊（FASS），成功分離和測定鉤藤中的柯諾辛堿和柯諾辛堿B（圖11）。

二、蛋白質(zhì)分析

蛋白質(zhì)不僅是有機(jī)體的構(gòu)建材料，也是生物功能分子，如激素、神經(jīng)遞質(zhì)、酶、抗體等。天然蛋白來自于基因分宜，但不一定能與基因一一對應(yīng)，翻譯后的修飾、代謝、復(fù)合或絡(luò)合等過程會使蛋白質(zhì)分子的種類復(fù)雜化，因此蛋白質(zhì)的分離分析是一個(gè)挑戰(zhàn)性的課題。毛細(xì)管電泳可用于蛋白質(zhì)分離研究中的諸多方面。

實(shí)例：Huan-Huan Zhao等人[2]結(jié)合壓力介導(dǎo)微分析（PMMA）和毛細(xì)管電泳的毛細(xì)管電泳方法建立了電泳介導(dǎo)的微量分析（EMMA），如圖12所示，并將其應(yīng)用于α-葡萄糖苷酶的動力學(xué)和抑制動力學(xué)研究，以及從天然黃酮中篩選出α-葡萄糖苷酶抑制劑。

三、DNA及其碎片分析

從1988年毛細(xì)管電泳被用于DNA分析后，DNA分析中的測序、PCR產(chǎn)物鑒定、基因突變研究、DNA損傷分析、臨床診斷等都開始大量使用毛細(xì)管電泳技術(shù)。

實(shí)例：急性腹瀉在全球均有較高的發(fā)病率和死亡率，主要發(fā)生在兒童和老年人群。目前引起嬰幼兒及兒童腹瀉的最常見病毒包括輪狀病毒（rotaviruses，RV）、諾如病毒（norovirus，NoV）、腸道腺病毒（adenoviruses，Adv）、扎如病毒（sapovirus，SV）及星狀病毒（humanastroviruses，HAstV）。目前約40%的腹瀉并不能快速準(zhǔn)確診斷出病因。病毒的分離培養(yǎng)及鑒定周期較長，免疫學(xué)方法在窗口期通常不能反映現(xiàn)癥感染，而且單病原體的PCR方法檢測通量較低。

蔡德豐等人[3]首次以兒童常見腹瀉病毒RV、NoV、Adv、SV及HAstV作為診斷目標(biāo)，建立多重PCR－毛細(xì)管電泳法檢測體系，以提高兒童腹瀉病毒診斷的效率。5種病毒陽性參考品擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳后均檢測到相應(yīng)片段，無明顯的干擾雜峰出現(xiàn)，其他腹瀉病原體核酸對反應(yīng)體系無影響，見圖13。

四、糖及其綴合物分析

糖是自然界中廣泛存在、被人類長期利用的化學(xué)物質(zhì)。糖不僅是動植物的能源(儲能材料如糖元)和燃料，也是代謝過程的中間產(chǎn)物。在植物和微生物體中，糖是主要的結(jié)構(gòu)材料。糖也是糖綴合物的重要部件。已經(jīng)證明，糖及其綴合物在細(xì)胞識別以及其他生物分子識別中，具有不可替代的或直接的作用。糖及其綴合物的分析因此受到了越來越廣泛的重視。利用毛細(xì)管電泳分離糖首先必須解決電荷問題。除糖醒酸、唾液酸、氨基糖以及一些硫酸化糖(硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素、肝素等)外，天然糖是不帶電荷的，不能在電場中遷移。理論上，可以采用絡(luò)合、解離、衍生等方法使糖帶電。

實(shí)例：牛舌草為紫草科植物意大利牛舌草Anchusa italica Retiz.或琉璃苣Borage officinales L.的地上部分，是維吾爾醫(yī)治療心腦血管疾病的常用藥材之一，具有祛寒補(bǔ)心、爽心悅智、潤燥消炎、止咳平喘等功效。多糖有顯著的免疫興奮、抗衰老、抗氧化活性和抗腫瘤等特性。研究牛舌草中的營養(yǎng)成分，特別是其中的糖類成分，對于深入研究其藥用價(jià)值具有重要意義。依明·尕哈甫等人[4]采用苯酚-硫酸法測定了牛舌草中多糖的含量，同時(shí)利用高效毛細(xì)管電泳法（HPLCE）測定了單糖組分(圖14），旨在為牛舌草的質(zhì)量評價(jià)和進(jìn)一步研究開發(fā)該中藥資源提供有益參考。

五、毛細(xì)管電泳聯(lián)用及微流控芯片技術(shù)

常規(guī)的毛細(xì)管電泳雖然具有諸多優(yōu)點(diǎn)，但是也存在一些問題，比如（1）由于進(jìn)樣量少，因而制備能力差；（2）由于毛細(xì)管直徑小，使光路太短，用一些檢測方法（如紫外吸收光譜法）時(shí)，靈敏度較低；（3）電滲會因樣品組成而變化，進(jìn)而影響分離重現(xiàn)性。因此，毛細(xì)管電泳的聯(lián)用技術(shù)對樣品處理、分離和檢測具有重要的改進(jìn)作用。

目前毛細(xì)管電泳的聯(lián)用技術(shù)主要分為分離-分離、分離-檢測、分離-鑒定、樣品處理-分離等類型，比如二維（多維）毛細(xì)管電泳、毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用、毛細(xì)管電泳-核磁共振聯(lián)用、毛細(xì)管電泳-化學(xué)發(fā)光聯(lián)用、流動注射-毛細(xì)管電泳聯(lián)用等等。

此外，微流控芯片技術(shù)也是毛細(xì)管電泳的一個(gè)重要發(fā)展方向。微流控芯片技術(shù)是把化學(xué)、生物、醫(yī)學(xué)分析過程的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測等基本操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上, 自動完成分析全過程。芯片毛細(xì)管電泳的通道雖有各種變化，但基礎(chǔ)是十字交叉結(jié)構(gòu)，如圖15所示，將樣品置于連接進(jìn)樣通道的任一電極槽中，在通道兩端加上合適的電壓，離子樣品便會遷移經(jīng)過分離通道。欲分離時(shí)，只需在垂直于進(jìn)樣通道的方向上施加電壓，位于交叉口的樣品就會進(jìn)入分離通道.關(guān)閉或降低進(jìn)樣通道兩端的電壓，可以使進(jìn)樣通道中的樣品不動或向兩邊回遷，而進(jìn)入分離通道的樣品則向檢測窗口方向遷移并發(fā)生分離，經(jīng)LIF或其他檢測器檢出樣品信號。

5.參考文獻(xiàn)

[1] Zhiying W , Haitao G , Meng C , et al. Separation and determination of corynoxine and corynoxine B using chiral ionic liquid and hydroxypropyl-β-cyclodextrin as additives by field-amplified sample stacking in capillary electrophoresis. Electrophoresis 2018, 39, 2195–2201.

[2] Zhao H H , Liu Y , Chen J . Screening of α-glucosidase inhibitors from natural flavonoids by in-capillary assay combining PMMA and EMMA. Analytical Methods, 2019, 11, 13712019.

[3] 蔡德豐,陳運(yùn)生,朱純青等. 多重PCR-毛細(xì)管電泳檢測兒童5種腹瀉病毒的方法建立及應(yīng)用. 臨床檢驗(yàn)雜志, 2020, 38(01):15-18.

[4] 依明·尕哈甫,王曉梅,熱娜·卡斯木等. 牛舌草多糖的含量測定以及毛細(xì)管電泳分析. 中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2019, 25(03):80-82.

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