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穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀的原理及測試用途

來源：時(shí)間：2022-11-28 11:34:55 瀏覽：8977次

1.引言
在歷史進(jìn)程中，為了推動(dòng)社會(huì)不斷發(fā)展，各類科學(xué)技術(shù)前后相繼、層出不窮。在眾多科學(xué)技術(shù)類別中，光譜學(xué)是通過物質(zhì)（原子、分子、團(tuán)族等）對光的吸收與發(fā)射來研究光與物質(zhì)相互作用的一門科學(xué)。其中，激光光譜技術(shù)按照光譜類型可分為以下幾種：吸收光譜、熒光光譜、拉曼光譜、紅外光譜等，不同的光譜從不同角度反映了物質(zhì)的不同特性[1]。
在此，我們先介紹一個(gè)概念：何為光致發(fā)光？物質(zhì)在吸收紫外和可見電光的時(shí)候，其分子受激躍遷至激發(fā)電子態(tài)，大多數(shù)分子將通過與其它分子的碰撞以熱的方式散發(fā)掉這部分能量；而另一部分分子以光的形式放射出這部分能量，放射光的波長不同于所吸收輻射的波長，該過程稱作光致發(fā)光[2]。
光致發(fā)光可按延遲時(shí)間分為熒光和磷光，其中基于化合物的熒光測量而建立起來的分析方法稱為分子熒光光譜法。由于不同種類的物質(zhì)有著不同的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和發(fā)光性質(zhì)，因此可以根據(jù)熒光光譜對不同種類的熒光物質(zhì)可以進(jìn)行定性及定量分析。
圖1 愛丁堡FLS980型穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀
我們常見的穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀（圖1）就是一種基于熒光光譜法原理，用于測定材料發(fā)光性能（如，激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、量子產(chǎn)率、熒光強(qiáng)度以及熒光壽命等）的分析儀器，是一種綜合型的熒光光譜儀，既可以測得覆蓋200～1700 nm波段的紫外可見-近紅外光的穩(wěn)態(tài)光譜，同時(shí)又可測得瞬態(tài)光譜。
2.穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀的原理
穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀主要以時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)原理（time-correlated single photon counting）來作為測量熒光壽命的工作基礎(chǔ)，該原理簡稱為“單光子計(jì)數(shù)（SPC）法”，利用脈沖光源激發(fā)樣品后，樣品發(fā)出熒光光子信號(hào)，每次脈沖后只記錄某特定波長單個(gè)光子出現(xiàn)的時(shí)間t，經(jīng)過多次計(jì)數(shù)，測得熒光光子出現(xiàn)的幾率分布P(t)，此P(t)曲線就相當(dāng)于激發(fā)停止后熒光強(qiáng)度隨時(shí)間衰減的I(t)曲線，這好比一束光通過一個(gè)小孔形成的衍射圖與單個(gè)光子一個(gè)一個(gè)地通過小孔長時(shí)間的累計(jì)可得完全相同的衍射圖的原理是一樣的。
以FS920型穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀為例，如圖2所示。
圖2 穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀原理示意圖[2]
以FS920型穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀為例，在此我們簡要介紹一下該儀器的工作原理：
時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)原理（time-correlated single photon counting）作為穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀測量熒光壽命的工作基礎(chǔ)，其簡稱“單光子計(jì)數(shù)（SPC）法”，其基本原理是，脈沖光源激發(fā)樣品后，樣品發(fā)出熒光光子信號(hào)每次脈沖后只記錄某特定波長單個(gè)光子出現(xiàn)的時(shí)間t，經(jīng)過多次計(jì)數(shù)，測得熒光光子出現(xiàn)的幾率分布P(t)，此P(t)曲線就相當(dāng)于激發(fā)停止后熒光強(qiáng)度隨時(shí)間衰減的I(t)曲線，這好比一束光通過一個(gè)小孔形成的衍射圖與單個(gè)光子一個(gè)一個(gè)地通過小孔長時(shí)間的累計(jì)可得完全相同的衍射圖的原理是一樣的。
當(dāng)熒光光譜儀進(jìn)行工作時(shí)，被測的熒光物質(zhì)在激發(fā)光照射下所發(fā)出的熒光，經(jīng)過單色器變成單色熒光后照射于光電倍增管上，由其所發(fā)生的光電流經(jīng)過放大器放大輸至記錄儀。一個(gè)激發(fā)，一個(gè)發(fā)射，采用雙單色器系統(tǒng)，可分別測量激發(fā)光譜和熒光光譜。
3.穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀的結(jié)構(gòu)
我們以O(shè)mniFluo900系列穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀（圖3）為例，簡要介紹該儀器的結(jié)構(gòu)組成：
儀器主要由光源及其電源、激發(fā)光波長選擇器件、樣品室、發(fā)射光波長選擇器件、光電探測器、輸出裝置、儀器控制和數(shù)據(jù)獲取分析和計(jì)算機(jī)組成。其中，高亮度復(fù)色光源及多波長單色光源、高靈敏度單光子探測器和大容量樣品室為核心部件，配合精心優(yōu)化的激發(fā)與發(fā)射光路設(shè)計(jì)，能顯著地提高了熒光信號(hào)探測的靈敏度。
圖3 OmniFluo900系列穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀的結(jié)構(gòu)框圖
4.熒光光譜
穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀對物質(zhì)進(jìn)行測量后的結(jié)果以光譜圖的形式呈現(xiàn)，通常情況下，熒光光譜包括激發(fā)光譜與發(fā)射光譜兩種（圖4），其中[3]：
圖4 熒光光譜示意圖[2]
（a）激發(fā)光譜是熒光強(qiáng)度以激發(fā)波長為函數(shù)的光譜
激發(fā)光譜是熒光物質(zhì)在不同波長的激發(fā)光作用下測得的某一波長處的熒光強(qiáng)度的變化情況，也就是不同波長的激發(fā)光的相對效率。
研究分子的激發(fā)光譜時(shí)，保持激發(fā)光強(qiáng)度不變，連續(xù)地調(diào)諧激發(fā)光的波長，并探測在某波長位置上分子發(fā)射的熒光強(qiáng)度變化。如測量波長選擇在發(fā)射強(qiáng)度的峰值處，則所測量得的激發(fā)光譜強(qiáng)度最大。通常激發(fā)光譜的形狀與吸收光譜的形狀很相像，因?yàn)榉肿拥奈者^程也是它的激發(fā)過程。
（b）發(fā)射光譜是熒光在發(fā)射波長上的強(qiáng)度分布
發(fā)射光譜是在某一固定波長的激發(fā)光作用下，熒光強(qiáng)度在不同波長處的分布情況，也就是熒光中不同波長的光成分的相對強(qiáng)度。
測量發(fā)射光譜時(shí)，激發(fā)光的波長和強(qiáng)度均保持不變，用發(fā)射單色儀進(jìn)行波長掃描，記錄在不同波長上的熒光強(qiáng)度就得到發(fā)射光譜。由于激發(fā)態(tài)和基態(tài)有相似的振動(dòng)能級(jí)分布，而且從基態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)躍遷到第一電子激發(fā)態(tài)各振動(dòng)能級(jí)的幾率與第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)躍遷到基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)的幾率也相近，因此吸收譜與發(fā)射譜呈鏡像對稱關(guān)系。
熒光光譜具有以下三個(gè)主要特點(diǎn)[2]：
（a）Stokes位移：激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間有波長差，發(fā)射光譜波長比激發(fā)光譜波長長；
（b）發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)；
（c）鏡像規(guī)則，熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜成鏡像對稱關(guān)系。
從得到的熒光光譜中，我們可以獲得以下主要譜參數(shù)[1]：
（a）激發(fā)光譜和發(fā)射光譜：激發(fā)光譜與吸收光譜極為相似，呈正相關(guān)；吸收光譜與發(fā)射光譜呈鏡像對稱關(guān)系；
（b）熒光壽命：去掉激發(fā)光后，分子的熒光強(qiáng)度降到去掉激發(fā)光時(shí)刻熒光強(qiáng)度I0的1/e所需要的時(shí)間，稱為熒光壽命（如圖5）；
圖5 熒光壽命示意圖[2]
（c）量子產(chǎn)率: 熒光量子產(chǎn)率是物質(zhì)熒光特性中最基本的參數(shù)之一。它表示物質(zhì)發(fā)射熒光的效率，通常用?來表示，定義為發(fā)射量子數(shù)和吸收量子數(shù)之比，即由熒光發(fā)射造成的退激分子在全部退激分子中所占的比例，又稱為熒光效率。
（d）熒光強(qiáng)度：測定熒光的相對強(qiáng)度與一些因素有關(guān)。熒光的相對強(qiáng)度可以用式1-1表示：
式中，F(xiàn)---熒光強(qiáng)度，K---儀器常數(shù)，?---量子產(chǎn)率，I---激發(fā)光強(qiáng)度，a---摩爾吸收系數(shù)，d---樣品池的光徑，c---樣品的濃度。
5.穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜分析的原理與特點(diǎn)
5.1 原理
穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜分析是一種基于物質(zhì)的光致發(fā)光現(xiàn)象而產(chǎn)生的熒光的特性及其強(qiáng)度進(jìn)行物質(zhì)的定性和定量的分析方法：
（a）定性分析：不同結(jié)構(gòu)熒光化合物都有特征的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，因此可以將熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的形狀、峰位與標(biāo)準(zhǔn)溶液的光譜圖進(jìn)行比較，從而達(dá)到定性分析的目的。
（b）定量分析：在低濃度時(shí)，溶液的熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成正比：F=Kc。其中，F(xiàn)為熒光強(qiáng)度，c為熒光物質(zhì)濃度，K為比例系數(shù)。這就是熒光光譜定量分析的依據(jù)。
值得注意的是，上述關(guān)系不適用于熒光物質(zhì)濃度過高的情況，熒光物質(zhì)濃度過高，其熒光強(qiáng)度反而降低。
5.2 特點(diǎn)
穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜分析具有以下特點(diǎn)[4]：
優(yōu)點(diǎn)：
（a）靈敏度高；
（b）選擇性強(qiáng)；
（c）試樣量少、方法簡單；
（d）提供較多的物理參數(shù)。
缺點(diǎn)：
（a）應(yīng)用范圍不夠廣泛;
（b）對環(huán)境敏感，存在多種干擾因素。
6.儀器功能
穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域，主要得益于其能實(shí)現(xiàn)多種功能性測試：
（a）能夠?qū)崿F(xiàn)不同類型樣品（包括液體，固體，薄膜以及粉末）的激發(fā)光譜、發(fā)射光譜（200～1700 nm）、同步掃描、動(dòng)力學(xué)光譜、三維光譜的測試；
（b）通過配備紫外可見區(qū)多個(gè)波段皮秒脈沖激光器以及超連續(xù)穩(wěn)態(tài)/脈沖白光激光器，能夠?qū)崿F(xiàn)覆蓋紫外可見近紅外波段穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)激發(fā)，能夠分別進(jìn)行熒光壽命、上轉(zhuǎn)換熒光壽命（30 ps～50 μs, 200 nm～1700 nm）和磷光壽命（1 μs～10 s, 200 nm～1700 nm）測試；
（c）利用大口徑積分球置于樣品倉內(nèi)，通過直接光路測量絕對熒光量子產(chǎn)量（200 nm～1700 nm）；
（d）能夠進(jìn)行不同溫區(qū)的變溫?zé)晒鈱?shí)驗(yàn)（4 K～500 K）；
（e）配備偏振附件能夠?qū)崿F(xiàn)熒光各向異性測試；
（f）可進(jìn)一步同顯微鏡耦合，進(jìn)行微區(qū)穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光測量、電致熒光測量等。
7.制樣要求
使用穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀對物質(zhì)進(jìn)行測量時(shí)，首先應(yīng)確定樣品具有熒光/磷光性能，樣品應(yīng)在光激勵(lì)下發(fā)光，否則所有熒光類測試都沒有意義！進(jìn)行測試時(shí)的制樣要求如下：
（a）常規(guī)熒光、磷光、壽命等測試：液體、粉末、薄膜（如果有襯底，請選用硅片等不發(fā)光、弱發(fā)光襯底）均可，具體而言：
液體要1 mL以上，一般5 mL左右，可能有溶度猝滅、溶劑效應(yīng)等因素帶來的影響，所以濃度根據(jù)自己樣品情況把控，不做要求；
粉末需要研磨較細(xì)，一般需要20 mg以上，需要填滿長1 cm、寬0.5 cm、深0.2 cm的槽；
塊狀或薄膜樣品要求基底尺寸在1×1 cm～2×2 cm之間，大約指甲蓋大小即可；
（b）變溫測試：變溫測試都不接受易揮發(fā)、易腐蝕的樣品，如高溫下有危害性需提前告知儀器操作者：
粉末需壓成厚度1 mm左右，直徑5 mm～1 cm左右的片子；
有襯底的薄膜樣品可以直接使用；
液體樣品，一定要備注好溶劑是什么、膨脹系數(shù)多大（如果膨脹系數(shù)過大，低溫下迅速結(jié)冰，會(huì)撐破比色皿）；
（c）絕對熒光量子產(chǎn)率測試：激發(fā)波長需≥340 nm；固體樣品用硫酸鋇作空白樣，溶液的樣品以溶劑作空白樣，所以溶液樣品測產(chǎn)率需同時(shí)提供溶劑。
8.應(yīng)用現(xiàn)狀
由于穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜分析技術(shù)具有重復(fù)性好、靈敏度高、選擇性強(qiáng)等特點(diǎn)，且作為目前分析物質(zhì)結(jié)構(gòu)與成分的有力手段之一，近年來被廣泛應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生和科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，具體而言包括以下幾個(gè)方面：
（a）熒光物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)分析；
（b）有熒光特性成分的定量分析；
（c）測試熒光量子產(chǎn)率；
（d）熒光壽命和磷光壽命測定；
（e）時(shí)間分辨熒光光譜測定；
（f）熒光偏振性質(zhì)測定。
張?jiān)伒热薣5]利用英國Edinburgh FLS920P型的穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀，對互為同分異構(gòu)體的胭脂紅、莧菜紅分子的吸收光譜和熒光光譜實(shí)驗(yàn)檢測，得到二者的光譜特性參數(shù)，并進(jìn)行對比。
胭脂紅、莧菜紅的吸收光譜和熒光光譜如圖6所示，其中圖6（a）為兩種物質(zhì)的吸收光譜，圖6（b）為兩種紅色素在發(fā)射波長450 nm下的激發(fā)光譜；圖6（c-d）為三維熒光光譜；圖6（e-f）為330 nm光激發(fā)下兩種色素的發(fā)射光譜，圖中的部分光譜特性參數(shù)如表1所示。從中可以看出，胭脂紅、莧菜紅兩種同分異構(gòu)體的吸收光譜（圖6a）線型相似，且都含有251與330 nm的吸收峰；不同之處為它們的最大吸收峰值波長分別為 506和521 nm，因此可以作為兩種物質(zhì)的特征吸收波長。熒光光譜也存在差異，它們的發(fā)射波長分別450和421 nm，且在同一波長的激發(fā)下，莧菜紅的熒光峰值強(qiáng)度明顯大于胭脂紅，如圖6（e-f）所示。
圖6 胭脂紅與莧菜紅的（a）吸收光譜和（b-f）熒光光譜[5]
表1 胭脂紅與莧菜紅的吸收光譜和熒光光譜特征參數(shù)
楊珀等人[6]利用FLS920型穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀對目標(biāo)產(chǎn)物QPXF在不同種類的溶劑中進(jìn)行熒光測試，實(shí)驗(yàn)中以365 nm波長激發(fā)，目標(biāo)產(chǎn)物QPXF在DCM、DMF、EA、乙醇和CN（5×10–5 mol/L）中的溶液熒光如圖7所示。
從結(jié)果中可以看出，QPXF的溶液熒光受溶劑極性影響，在極性小的DCM和EA中為λem = 460 nm的藍(lán)光，在極性大的DMF，ETOH和CN中為λem = 505 nm左右的藍(lán)綠色光。同時(shí)，溶液熒光強(qiáng)度隨著溶劑極性的增大而減小。
圖7 QPXF 在不同溶劑中的熒光圖譜[6]
9.結(jié)語
利用穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀可以對具有不同結(jié)構(gòu)的熒光化合物進(jìn)行定性與定量分析，得益于靈敏度高、試樣量少、操作簡單等特點(diǎn)，該光譜儀在物理、化學(xué)、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，對于推動(dòng)科學(xué)研究的進(jìn)步具有重要意義！
10.參考文獻(xiàn)
[1] 周穎. 超支化聚芴衍生物的穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜特性[D]. 西安電子科技大學(xué), 2008.
[2] 【科研方法15】一文帶你看懂穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜原理與應(yīng)用
[3] 趙南明，周海夢．生物物理學(xué)．高等教育出版社．2000，17：289—293．
[4] 姚文華. 熒光分析儀的原理及其在生化工程上的應(yīng)用[J]. 醫(yī)藥工程設(shè)計(jì), 1991.
[5] 張?jiān)? 陳國慶, 朱純,等. 胭脂紅和莧菜紅分子結(jié)構(gòu)與光譜性質(zhì)的對比研究[J]. 光譜學(xué)與光譜分析, 2015, 35(11):3017-3022.
[6] 楊珀, 錢永, 袁月鵬. 一種新型席夫堿的合成及其紫外線屏蔽性能[J]. 工程塑料應(yīng)用, 2020, v.48;No.364(02):106-111.

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