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蛋白質(zhì)免疫印跡實驗（WB）的常見問題分析

來源：測試GO 時間：2022-09-07 14:16:01 瀏覽：2667次

1、蛋白質(zhì)免疫印跡實驗中蛋白樣本為什么要進行還原和變性？

答：為了使樣本被還原和變性，樣品緩沖液中會含有十二烷基硫酸鈉(SDS)和β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)。SDS是一種變性劑，用來打破蛋白的高級結(jié)構(gòu)，變成初級的氨基酸結(jié)構(gòu)，同時以恒定的質(zhì)量比包被蛋白質(zhì)，使其帶上負(fù)電荷。這一恒定的負(fù)電荷比是下一步凝膠電泳分離的關(guān)鍵。β-巰基乙醇和DTT都是還原劑，用來斷開蛋白自身的二硫鍵，進一步使蛋白質(zhì)變成線性結(jié)構(gòu)，此圖中簡單地展示了這一過程。順便提一下，有些抗體只能夠識別目標(biāo)蛋白的天然結(jié)構(gòu)，在這種情況下，樣本不需要被還原和變性。所以還原和變性的步驟可以省略。但是，大多數(shù)蛋白質(zhì)印跡分析都需要在還原和變性的體系中進行。

蛋白質(zhì)免疫印跡實驗圖片

2、為什么檢測重組蛋白時難以獲得條帶？

答：抗體檢測重組蛋白質(zhì)時，存在難以克服的困難，有必要加以考慮。所以推薦確保樣品中表達(dá)的重組蛋白包含所用抗體的免疫原序列。同時，如果重組蛋白帶有標(biāo)簽，標(biāo)簽可能阻止抗體接近表位。盡可能讓標(biāo)簽位于重組蛋白的C或N末端，以降低這種情況發(fā)生的可能性（而不是位于蛋白質(zhì)的閱讀框中間）。

3、牛奶和 BSA 封閉有區(qū)別？

答:抗體可能對封閉劑敏感，一般來講，BSA會產(chǎn)生更清晰的結(jié)果，因為BSA含有較少的蛋白，因而抗體較少與其發(fā)生交叉反應(yīng)。但并非總是如此，有些抗體在牛奶中的效果更好，因為牛奶含有更多種類的封閉蛋白，能封閉更多不同類型的蛋白質(zhì)。

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